發布時間：2020-02-04所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:為了研究長期定位施肥對棕壤中氨氧化細菌(ammonia-oxidizingbacteria,AOB)種群結構多樣性和垂直分布特征的影響,本研究采用化學分析、熒光定量PCR(qPCR)和變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術,針對沈陽農業大學試驗區不同施肥方式(不施肥、低量無機氮肥、高
摘要:為了研究長期定位施肥對棕壤中氨氧化細菌(ammonia-oxidizingbacteria,AOB)種群結構多樣性和垂直分布特征的影響,本研究采用化學分析、熒光定量PCR(qPCR)和變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術,針對沈陽農業大學試驗區不同施肥方式(不施肥、低量無機氮肥、高量無機氮肥、無機氮肥與有機肥配施)下不同土壤深度(0~20cm、20~40cm、40~60cm)的土壤理化性質、AOB豐度及種群多樣性進行分析,比較不同施肥方式對土壤AOB種群的影響。結果顯示,與不施肥相比,施肥會降低土壤pH,增加土壤銨態氮(70.5%~939.21%)和硝態氮(253.20%~625.48%)含量。隨土壤深度增加,土壤pH升高,銨態氮和硝態氮含量除低量無機氮肥處理外,多呈降低趨勢。土壤增施氮肥可提高AOB豐度,降低總細菌豐度。其中,0~20cm土層中AOB豐度較高,且高量無機氮肥處理的AOB數量最高,為9.65×105拷貝數·g-1(干土)。DGGE圖譜分析顯示,不同處理下,AOB群落結構多樣性指數存在明顯差異(P<0.05),各多樣性指數均在表層(0~20cm)最高,增施氮肥則顯著降低AOB的多樣性。聚類分析表明,4個施肥處理中,高量無機氮肥處理聚為一類,其他處理則因土壤深度不同而異;3個土壤深度中,除不施肥處理外,所有施肥處理均表現為0~20cm、20~40cm土層發生聚類,40~60cm則明顯與其他兩層分開。冗余梯度分析(RDA)顯示,硝態氮(P=0.027)是造成影響AOB群落結構差異的主要原因。上述研究結果表明,長期定位施肥土壤AOB的數量和群落結構多樣性受施肥方式顯著影響,并表現出明顯的垂直分布特征。與無機氮肥相比,有機無機配施處理有助于改善土壤pH,維持不同土壤深度下AOB群落結構多樣性。
關鍵詞:棕壤;施肥方式;氮肥;氨氧化細菌(AOB);群落結構;土壤深度
硝化作用是土壤氮素轉化的關鍵過程,由氨氧化細菌(ammonia-oxidizingbacteria,AOB)和氨氧化古菌(ammonia-oxidizingarchaea,AOA)驅動的氨氧化過程作為硝化作用的限速步驟,可通過其數量、多樣性、結構組成的改變來響應土壤氮素轉化[1]。許多研究指出,酸性土壤中長期施肥可改變AOA的豐度和群落結構,中性或堿性土壤中AOB比AOA更敏感。Chen等[2]在研究水稻(OryzasativaL.)酸性紅壤發現,各施肥處理中AOA豐度變化明顯,而AOB幾乎沒有區別。Wu等[3]研究小麥(TriticumaestivumL.)中性土壤中發現,長期施肥(22年)顯著改變AOB的群落結構,而AOA則保持不變。近年來,Hayatsu等[4]在日本茶園土壤中成功分離出嗜酸性AOB,使得這類微生物在酸性土壤中的作用有了新的認知。研究表明,土壤pH、氮素種類、土壤類型、施肥方式和作物品種等因素,均可對氨氧化微生物產生特異的選擇性。Fan等[5]研究長期施肥水稻土指出,AOB的數量和群落結構較AOA變化明顯,增施氮肥可顯著提高AOB的多樣性。Ai等[6]發現,小麥與玉米(ZeamaysL.)輪作潮土中,施加氮肥可顯著提高AOB數量。Kumar等[7]和Liu等[8]研究酸性土壤時均指出,配施有機肥可顯著增加土壤中AOB的數量和群落結構多樣性。Ouyang等[9]在美國的猶他州粉砂壤土中也發現,有機氮肥可顯著提高AOB-amoA基因豐度,且氨氧化細菌的活性隨有機肥料增加而增加。
相關期刊推薦：《中國生態農業學報》1993年創刊。由中國科學院遺傳與發育生物學研究所;中國生態經濟學會主辦。主要刊登土壤、施肥與植物營養、水資源及其高效利用、作物水分生理生態、農業高效栽培技術與機理、作物抗性生理生態、抗性育種、病蟲害防治、生物多樣性保護、資源優化配置及其效益分析、農業生態工程技術、無公害農產品生產技術、農業環境污染防治及農業可持續發展等方面的研究報告、研究簡報及綜述,以及生態農業建設和生態農業示范區建設典型模式與典型經驗等。有投稿需求的作者，可以咨詢期刊天空在線編輯。
農業生態系統中,不同施肥方式可通過影響土壤理化特征,改變功能微生物的豐度及群落結構組成,進而對土壤質量和生態功能產生影響。許多研究表明,較單施化肥相比,無機有機氮肥配施的農田管理模式,有助于優化土壤微生物群落結構,改良土壤理化屬性和養分供應狀況,維持并提高土壤質量。Kumar等[7]研究長期施肥的水稻土時指出,無機有機肥配施可以緩解土壤酸化,穩定土壤功能和豐富功能基因。Zhao等[10]研究小麥與水稻輪作的黏土時指出,無機有機肥配施可顯著提高土壤有效養分、微生物量以及微生物多樣性,對于可持續的農業生產來說,無機有機肥配施是一種較好的施肥方式。然而,在長期施肥模式下,針對棕壤中氨氧化細菌群落結構多樣性對不同施肥方式,特別是有機無機肥配施的響應特征,及其隨土壤深度增加的變化差異等相關研究少有報道,這些研究結果對于探索不同施肥模式下土壤氮素轉移與變化規律具有指導意義。
為進一步認識長期定位不同施肥模式下棕壤氨氧化細菌的變化特征,采用PCR-DGGE和qPCR技術,以沈陽農業大學長期定位試驗田為平臺,比較4種施肥方式下,長期定位棕壤AOB的豐度與種群結構差異,同時結合土壤理化性質的分析,探討AOB對不同施肥方式的響應機制和垂直分布特征,為維持土壤質量、穩定生產力提供依據。
1材料與方法
1.1試驗材料與樣品采集
試驗地位于遼寧省沈陽市沈陽農業大學長期定位試驗站(41°49′N,123°34′E),該地區屬于大陸性季風氣候,年平均氣溫8.0℃,年均降水量為705mm。土壤類型屬于中厚層棕壤。長期定位試驗始于1987年,種植作物為玉米。施肥方式設置為4個處理,分別為不施肥[CK,0kg(N)·hm-2]、施低量氮肥(N2,年施尿素氮135kg·hm-2)、施高量氮肥(N4,年施尿素氮270kg·hm-2)和尿素氮肥與有機肥配施(M2N2,其中尿素氮135kg·hm-2;有機肥為豬廄肥,其中含純N135kg·hm-2)。小區面積為69m2,不同施肥處理3次重復。
土壤采集于2015年7月20日(玉米抽雄期),采用對角線五點采樣法,采集0~20cm、20~40cm和40~60cm剖面深度的土壤。每個小區同一土層的土壤組成混合代表樣,所取土壤去除雜物,碾碎后混勻,一部分用冰盒保存帶回實驗室后-80℃保存,另一部分裝入自封袋帶回實驗室后4℃保存,用鮮土樣測定硝化強度、銨態氮和硝態氮含量,剩余土壤自然風干后測定土壤pH。
1.2土壤理化指標的測定
土壤pH測定采用電位法(土∶水=1∶2.5);土壤銨態氮和硝態氮用0.01mol·L-1CaCl2浸提新鮮土樣后,采用連續流動注射分析儀(AA3-HR,SEAL,Germany)測定;硝化強度的測定參照趙爽等[11]的方法。
1.3土壤微生物總DNA提取
土壤微生物DNA的提取采用E.Z.N.Z.TMSoilDNAKit(OMEGA),獲得DNA后用Qubit測定濃度,并采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA質量,-20℃保存。
1.4細菌16SrDNA和AOBamoA基因的熒光定量PCR
分別用引物515F/907R和amoA-1F/amoA-2R擴增細菌16SrDNA和AOBamoA基因,PCR體系為50mL,分別含10×Buffer5.0mL,dNTP(各2.5mmol×L-1)4.0mL,上下游引物(10mmol×L-1)各1.0mL,DNA模板(1~10ng)2mL,rTaq(5U×mL-1)1.0mL,最后用ddH2O補至50.0mL。PCR程序:94℃預變性5min;94℃變性30s,53℃退火30s,72℃延伸30s,45個循環;最后72℃延伸10min�；厥誔CR產物連接至pMD18-T載體,轉化至大腸桿菌DH5α感受態中,經Amp+、IPTG和X-gal的LB平板篩選陽性克隆,測序分析。
標準曲線的制作:提取測序正確的細菌16SrDNA、AOBamoA基因的陽性克隆質粒,用Qubit測其濃度,按10倍梯度稀釋質粒成實時熒光定量PCR測定標準品,-20℃保存。
熒光定量PCR在ABI7500StepOnePlus上進行,反應體系為20mL,分別含GoTaq®qPCRMasterMix10.0mL,上下游引物各0.8mL(10mmol×L-1),DNA模板2.0mL(1~10ng),用ddH2O補至20.0mL。qPCR引物及程序如表1所示。
將稀釋100倍的土壤DNA樣品與標準品一起進行Real-TimePCR檢測,包括陰性對照在內每個樣品設3個重復。細菌16SrDNA基因標準曲線的R2為0.99,擴增效率為99.67%,AOB-amoA基因標準曲線的R2為0.993,擴增效率為107.73%。
1.5氨氧化細菌16SrDNA的PCR擴增
利用巢式擴增方法擴增氨氧化細菌的V3區域,反應體系為25μL,其中模板1μL、前后引物(20mmol×L-1)各0.5μL、2´TaqMasterMix12.5μL、DNA-FreeWater10.5μL。共使用3對引物8F/1492R、CTO189F/654R、341F/519R(表2),其中CTO189F/654R是針對β-AOB的一對特異性較高的引物。最后得到的PCR產物約190bp,用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后可用于DGGE分析。
1.6PCR產物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析
移取PCR產物15μL進行DGGE分析,變性劑梯度范圍為35%~55%,聚丙烯酰胺凝膠濃度為8%(100%的變性劑為尿素7mol×L-1和40%的去離子甲酰胺),在1´TAE緩沖液中,180V、60℃緩沖液中電泳6h。電泳后采用GeneFinder法進行染色。然后用Gel-DocXR凝膠成像系統照相保存。
1.7數據分析
數據處理采用SPSS20.0數據處理軟件,差異顯著性分析利用單因素方差分析(ANOVA)和多重比較法(Duncan);DGGE圖譜分析采用Quantity-One圖像分析軟件。土壤理化因子與氨氧化微生物群落特征相關性分析采用Pearson相關分析法。用Shannon多樣性指數(H)、均勻度(EH)和豐富度(S)等評價AOB群落結構多樣性。采用CANOCO4.5.1軟件(MicrocomputerPower,Ithaca,USA)分析AOB群落結構和土壤理化因子間的關系。多樣性指數計算公式為:H=-∑(ni/N)ln(ni/N),EH=H/lnS,式中ni為單一條帶的強度,N為所有條帶的總強度,S為每一泳道總的條帶數。
2結果與分析
2.1長期不同施肥處理下土壤理化性質的變化
不同施肥處理對棕壤理化性質產生不同影響(表3)。與不施肥相比,所有施肥處理均顯著降低了0~20cm土壤的pH(4.55~5.47);同時,施加無機肥的N2和N4處理顯著降低40~60cm土壤pH,而施加有機肥的M2N2處理則表現出相反結果(P<0.05)。同一施肥處理下,0~20cm土壤pH不同程度地低于其他土壤深度。土壤氮素含量表現為,與不施肥相比,所有施肥處理均可顯著增加土壤NH4+-N(0.51~5.30mg·kg-1)和NO3--N(6.24~45.27mg·kg-1)的含量(P<0.05)。除N2處理外,同一施肥處理中,0~20cm土壤銨態氮與硝態氮含量均不同程度高于其他土壤深度。N2處理在相同土壤深度下,與CK處理間硝化強度無明顯差異,M2N2與N4處理可明顯增加表層土壤(0~20cm)硝化強度。
2.2長期不同施肥處理下土壤總細菌和AOB數量的變化
以16SrDNA和細菌amoA基因為靶標,用熒光定量PCR測定土壤總細菌和AOB的數量。結果顯示,不同施肥處理下土壤總細菌數量為4.30×109~7.27×1011拷貝數·g-1(干土)。與不施肥相比,所有施肥處理均顯著降低了0~20cm土壤細菌的數量;各施肥處理間,在相同土壤深度下,N4處理土壤細菌數量均不同程度地低于N2和M2N2處理。相同施肥處理下,M2N2土壤細菌數量在不同土層中差異不明顯,其他處理均表現為40~60cm土壤細菌數量均顯著低于0~20cm土層(圖1)。
土壤AOB的數量為1.31×105~9.65×105拷貝數·g-1(干土)。與不施肥相比,低量氮肥處理N2顯著增加了不同深度土壤中AOB數量,高量氮肥處理N4中AOB在20~40cm土層迅速升高,在0~20cm和40~60cm土層則顯著降低。有機無機肥配施處理(M2N2)對0~40cm土壤中AOB無明顯影響,卻顯著降低40~60cm土層AOB數量(圖1)。總體上,土壤施肥后,細菌和氨氧化細菌主要分布在0~40cm土層區域中。
土壤AOB與總細菌的數量比值為45.4~55.2。施肥總體上增加了二者的比值,且無機氮肥對二者比值的增加不同程度地高于無機有機氮肥配施處理(M2N2),該結果應與增施氮肥后土壤細菌數量下降有關。
2.3長期不同施肥處理下土壤AOB細菌群落結構的變化
2.3.1DGGE圖譜
DGGE技術是研究微生物種群結構的免培養手段之一,盡管檢測通量有限,且只能檢測生境中數量占優勢的微生物種群,該技術重現性強、檢測速度快、價格經濟、結果直觀等特點,使其一直被廣泛應用于不同生境中微生物種群多樣性及空間分布檢測等相關領域[15-16]。不同施肥方式下土壤AOB群落結構的DGGE圖譜見圖2A。不同處理土壤AOB群落結構的DGGE圖譜在電泳條帶數目、強弱和遷移位置均存在一定程度的差異,顯示出AOB對環境因子變化的響應特征。與不施肥相比,施肥處理土壤AOB的條帶數減少。圖中的共有條帶(8、14和19)說明不同施肥處理土壤存在共有的AOB類群,但其亮度不同,說明這些AOB可能通過數量改變來響應環境的變化。條帶17、22只存在于不施肥(CK)處理土壤中,而條帶9、10、18只存在于高量無機氮肥(N4)處理土壤中,說明這些AOB類群對土壤中氮素變化較為敏感。聚類分析顯示(圖2B),12個處理(施肥處理´土層)聚為兩大類群,N4處理單獨聚成一類,且0~20cm與20~40cm土層土壤之間的相似性達71%,說明施加高量無機氮肥可明顯改變土壤中AOB的群落結構。另外,所有供試處理0~20cm與20~40cm土層土壤明顯聚為一類,說明AOB群落結構在0~20cm和20~40cm土層較為相似,但在深層土壤(40~60cm)發生明顯變化。
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