番鴨細小病毒VP3基因在昆蟲細胞中的表達與鑒定

發布時間：2020-01-11所屬分類：農業論文瀏覽：1次

摘 要： 摘要:為使番鴨細小病毒VP3基因在昆蟲細胞中正確表達，根據已發表的該病毒的VP3基因序列設計1對引物。以PCR方法擴增VP3基因;構建轉移載體pFastBac1-VP3，轉化DH10Bac感受態細胞，得到重組BacmidDNA;轉染昆蟲細胞Sf9，獲得重組桿狀病毒rBac-VP3。通過間接免疫

　　摘要:為使番鴨細小病毒VP3基因在昆蟲細胞中正確表達，根據已發表的該病毒的VP3基因序列設計1對引物。以PCR方法擴增VP3基因;構建轉移載體pFastBac1-VP3，轉化DH10Bac感受態細胞，得到重組BacmidDNA;轉染昆蟲細胞Sf9，獲得重組桿狀病毒rBac-VP3。通過間接免疫熒光、Western-blot試驗、SDS-PAGE分析目的片段在昆蟲細胞中的表達情況。成功構建了轉移載體pFastBac1-VP3，獲得重組桿狀病毒rBac-VP3，VP3基因在桿狀病毒表達系統中成功表達，得到大小約58ku的蛋白。

　　關鍵詞:番鴨細小病毒;VP3基因;桿狀病毒表達系統;轉染;sf9細胞

　　番鴨細小病毒病是由番鴨細小病毒(muscovyduckparvovirus，簡稱MDPV)引起的雛番鴨的一種急性、敗血性傳染病[1]，主要感染3周齡以內的雛番鴨，俗稱三周病[2-3]。該病作為一種病毒病，重在預防，目前疫苗接種是最主要的預防方式。我國多在雛番鴨1日齡時進行MDPV弱毒苗免疫，但由于母源抗體的影響，以致弱毒苗不能對番鴨完全保護，國內外常有該病的報道[4]。因此，研究更為有效安全的MDPV疫苗是目前迫切的任務。

　　桿狀病毒載體表達系統(baculovirusexpressionvectorsystem，簡稱BEVS)是一個以昆蟲桿狀病毒為外源基因載體，以昆蟲和昆蟲細胞為受體的真核表達系統。該表達系統具有安全性高、對外源基因容量大、較好地轉錄后加工修飾等優點[5]。在桿狀病毒表達系統這些優點的基礎上，眾多學者對該系統進一步進行研究改進，最為重要的是Bac-to-Bac系統的構建[6]，使桿狀病毒表達系統能更好地適應基礎研究和應用開發的需要。

　　本研究旨在Bac-to-Bac系統中成功表達番鴨細小病毒的VP3基因，為制備VLPs提供基礎。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　1.1.1菌種與血清MDPV尿囊液、MDPV抗鼠多抗、PFastBac1載體、大腸桿菌DH5α、DH10Bac感受態細胞由筆者所在實驗室提供。

　　1.1.2酶類和主要試劑pfuDNA聚合酶、限制性內切酶NotⅠ、XhoⅠ及T4DNA連接酶購自加拿大Fermentas公司;質粒抽提試劑盒和膠回收試劑盒購自愛思進生物技術(杭州)有限公司;FITC標記的羊抗鼠二抗購自SouthernBiotech公司;辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG購自武漢博士德生物工程有限公司;牛血清白蛋白(BSA)購自美國Sigma公司。

　　1.2方法

　　1.2.1引物設計與合成參考GenBank中已發表的MDPVVP3的基因序列(登錄號:AY510603.1)，設計1對用于擴增VP3基因的引物，引物由英濰捷基(上海)生物技術有限公司合成。引物序列為VP3-FB-F:5'-TATGGATCCATGGCAGAGGGAGGAAGC-3';VP3-FB-R:5'-TAAGAGCTCCAGATTCTGAGTCAAATACC-3'。序列下劃線處分別為上下游引物插入的NotⅠ和XhoⅠ酶切位點。

　　1.2.2VP3基因的擴增將MDPV尿囊液煮沸5min，-20℃冷凍10min，4℃、12000r/min離心5min，取上清為模板，VP3-FB-F、VP3-FB-R為上下游引物擴增VP3基因。反應體系:模板2μL、dNTP(2.5mmol/L)5μL、10×PCR緩沖液5μL、上下游引物(25mmol/L)各2μL、pfuDNA聚合酶(5U/μL)1μL，加雙蒸水至50μL。PCR反應條件:95℃預變性3min;95℃變性30s，49℃退火30s，72℃延伸2min，35個循環;72℃延伸10min。PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

　　1.2.3轉移載體pFastBac1-VP3的構建與鑒定按膠回收試劑盒的說明書回收目的基因，經NotⅠ和BamHⅠ酶切后與經同樣酶切的pFastBac1載體連接，轉化DH5α感受態細胞，涂布于含100μg/mL氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，37℃培養過夜。挑取可疑單菌落培養，PCR初步鑒定，將鑒定正確的菌落提取質粒，并以NotⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定。酶切鑒定正確的菌株送至英濰捷基(上海)生物技術有限公司測序，測序正確的命名為轉移載體pFastBac1-VP3。

　　1.2.4重組BacmidDNA的獲得與鑒定將PFastBac1-VP3重組轉化DH10Bac感受態細胞，涂布于含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL慶大霉素、10μg/mL四環素、100μg/mLX-gal及40μg/mL異丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的LB平板上，37℃培養48h后出現藍白斑現象。將疑似的白色單菌落接種到含有50μg/mL卡那霉素、7μg/mL慶大霉素及10μg/mL四環素的10mL抗性LB試管中，37℃、250r/min搖床培養過夜培養，提取重組BacmidDNA。

　　以M13上下游引物對重組BacmidDNA進行鑒定，反應體系為重組BacmidDNA2.0μL，上下游引物(25mmol/L)各1.0μL，dNTP(2.5mmol/L)2.5μL，10×PCR緩沖液2.5μL，MgCl2(25mmol/L)2.0μL，TaqDNA酶(5U/μL)0.5μL，加雙蒸水至25μL。PCR反應條件:93℃預變性3min;94℃變性45s，49℃退火45s，72℃延伸3min，30個循環;72℃延伸10min。PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

　　1.2.5重組桿狀病毒的獲得與擴增將重組BacmidDNA轉染處于對數生長的昆蟲細胞Sf9，27℃培養，待Sf9細胞出現明顯的病變(細胞核變大，細胞變大變圓，從瓶壁脫落)，收集上清即為P1代重組病毒。P1代重組桿狀病毒滴度一般比較低，須要用P1代病毒繼續傳代提高滴度。將P1代病毒感染Sf9細胞，48h后收集細胞上清，即P2代重組桿狀病毒。以P2代病毒感染細胞，得到P3代重組桿狀病毒。

　　1.2.6重組蛋白的鑒定

　　1.2.6.1SDS-PAGE和Western-blot試驗將P3代病毒感染Sf9細胞，正常Sf9細胞作為空白對照，待被感染細胞出現明顯病變時，收集細胞沉淀。用適量磷酸緩沖鹽溶液(PBS)重懸沉淀，與上樣緩沖液混勻，煮沸10min，進行SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色、脫色，分析結果。

　　SDS-PAGE結束后，電轉印至PVDF膜，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，加入1∶400稀釋的一抗(MDPV多抗)，37℃孵育2h，PBS洗滌5遍。加入1∶3000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1.5h，PBS洗滌5遍，而二氨基聯苯胺(DAB)顯色。

　　1.2.6.2間接免疫熒光試驗將P3代病毒感染Sf9細胞，以正常Sf9細胞作為空白對照，48h后，棄培養基上清，PBS洗滌。以預冷的甲醇固定10min，PBS洗滌后，加入1∶400稀釋的一抗(MDPV多抗)，37℃孵育1h。加入1∶500稀釋的FITC標記的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育45min，PBS洗滌后，熒光顯微鏡下觀察結果。

　　2結果與分析

　　2.1VP3基因的克隆

　　以處理的MDPV尿囊液為模板進行PCR擴增，經0.8%瓊脂糖凝膠電泳，結果出現1條約1602bp大小的特異性條帶(圖1)，與預期結果相符。

　　2.2轉移載體pFastBac1-VP3的構建與酶切鑒定

　　將PCR擴增的VP3基因經瓊脂糖凝膠分離后，切膠回收，用BamHⅠ和NotⅠ雙酶切，與經同樣酶切的pFastBac1質粒連接，獲得轉移載體pFastBac1-VP3。經BamHⅠ和NotⅠ雙酶切得到約1.6kb和4.7kb的2條條帶(圖2)，與預期結果相符，且DNA測序結果證明VP3基因克隆正確。

　　2.3重組BacmidDNA的PCR鑒定

　　以M13上下游引物對重組BacmidDNA進行PCR鑒定。由圖3可知，重組質粒以M13為上下游引物時，出現大小約3.9kb(2.3kb+1.6kb)的條帶;以VP3-PFB-F、VP3-PFB-R為上下游引物時，出現大小約1.6kb的條帶，與預期結果相符。

　　2.4重組蛋白的鑒定

　　2.4.1SDS-PAGE分析以P3代重組桿狀病毒感染Sf9細胞，待細胞出現明顯病變時，收集細胞，進行SDS-PAGE。染色脫色后，觀察結果。由圖4可知，被感染的Sf9細胞在約58ku處出現特異性條帶，空白對照沒有。

　　2.4.2Western-blot檢測對重組蛋白進行Western-blot檢測。由圖5可知，重組蛋白在約58ku處出現特異性條帶，與預期結果相符。表明在Sf9細胞中表達的重組蛋白能與MDPV多抗發生特異性反應。

　　2.4.3間接免疫熒光試驗以P3代重組桿狀病毒感染Sf9細胞，待細胞出現明顯病變時，以甲醇固定進行間接免疫熒光試驗。由圖6可知，P3代病毒感染的細胞出現較強的綠色熒光，而正常細胞中未見熒光。

　　3討論

　　番鴨細小病毒最早被報道是在1991年，林世堂等認為是類似小鵝瘟的番鴨病毒病的一種新病毒[1]，隨后程由銓等分離到2株病毒，最后確定本病的病原是細小病毒科的一個新成員[7]。番鴨細小病毒的基因組為單鏈線性DNA，全長5136bp，包含2個主要的開放閱讀框(ORF)。左側ORF編碼非結構蛋白(NS);右側ORF編碼病毒的3種結構蛋白(VP1、VP2、VP3)。其中VP3是主要的衣殼蛋白，約占總蛋白的80%，能刺激機體產生抗體[8-9]，是誘導機體產生保護性抗體的主要抗原[10]。

　　桿狀病毒基因組較大，不易通過常規的酶切連接將外源片段插入其中，通常是將外源片段連接到轉移載體上[11]，然后轉移載體與桿狀病毒重組，獲得重組桿狀病毒。最初重組桿狀病毒構建時應用的是野生型病毒，該方法重組效率僅0.1%～1.0%[12]，費事費力，因此在應用上有一定的難度。隨著桿狀病毒載體和篩選方法的不斷改進，1993年Bac-to-Bac技術問世。Bac-to-Bac技術是根據F因子載體原理，構建一種桿狀病毒穿梭載體[13]，該載體既可像普通質粒一樣在大腸桿菌中復制，又能感染昆蟲細胞。該方法可使桿狀病毒的最大重組率高達100%，并且操作簡單，提高了工作效率。

　　本試驗選擇MDPV主要衣殼蛋白基因VP3，將其克隆至pFastBac1載體上，構建轉移載體pFastBac1-VP3;轉化DH10Bac感受態細胞，藍白斑篩選及PCR鑒定后，獲得重組BacmidDNA。將重組BacmidDNA感染昆蟲細胞，制備重組桿狀病毒rBac-VP3，并通過SDS-PAGE分析、Western-blot、間接免疫熒光試驗檢測重組蛋白的表達。結果證明，VP3基因能在桿狀病毒系統中正確表達，為病毒樣顆粒在昆蟲細胞中的自主裝配提供了有力條件和基礎。

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