發布時間：2019-12-06所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:采用水蒸氣蒸餾法提取野菊花揮發油成分，通過氣相色譜質譜聯用技術鑒定了其中36種化學成分，主要為萜類化合物及其衍生物，其中姜黃烯和氧化石竹烯相對含量較高，均占10%以上.分別采用不同的抗菌活性檢測模型測定了野菊花揮發油的抑菌活性.結果顯示:野菊
摘要:采用水蒸氣蒸餾法提取野菊花揮發油成分，通過氣相色譜—質譜聯用技術鑒定了其中36種化學成分，主要為萜類化合物及其衍生物，其中姜黃烯和氧化石竹烯相對含量較高，均占10%以上.分別采用不同的抗菌活性檢測模型測定了野菊花揮發油的抑菌活性.結果顯示:野菊花揮發油對3株革蘭氏陽性葡萄球菌和2株革蘭氏陰性腸道桿菌的生長均表現出一定抑制活性，且對革蘭氏陽性球菌的抑制能力稍強于陰性桿菌.帶毒平板法活性測定結果表明，野菊花揮發油對蕎麥立枯絲核菌表現出了較強的抑制活性，其抑制中濃度(IC50)值為0.02mg/mL.
關鍵詞:野菊花;揮發油;氣相色譜—質譜聯用技術;抗菌活性;立枯絲核菌
0引言
植物揮發油屬于植物的次生代謝產物，大多來源于植物的莖、葉、花、果實、種子以及表皮等部位，可以通過物理壓榨、水蒸氣蒸餾、溶劑提取等方式收集提煉得到[1].研究表明，植物揮發油主要為萜類化合物、脂肪族化合物、芳香族化合物以及其他含氮硫類化合物等，其中萜類化合物為植物揮發油的主要組成成分[2].研究發現，植物揮發油具有抗菌消炎、抗病毒、抗氧化以及保護心血管等藥理作用[3-4]，其一直也是食品、醫藥以及農業環保等多個領域的研究熱點[5].
野菊為菊科多年生草本植物，廣泛分布于我國東北、華北、華中、華南及西南各地[6].野菊以全草入藥，具有清熱解毒、疏風散熱、明目降壓等功效，可以用于預防和治療感冒、肝炎、癰癤等疾病[7].野菊花為野菊的頭狀花序部分，是入藥主要部位，常用于提取分離藥效成分.目前對野菊花揮發油的研究多集中在其揮發性成分的分析檢測方面，對野菊花揮發油抗菌活性方面的研究相對較少.對此，本研究以野菊花為材料，提取其揮發性成分，同時采用不同抗菌活性檢測模型測定野菊花揮發油對細菌和真菌的抑制活性，擬為野菊花揮發油的進一步開發利用提供依據.
1材料與方法
1.1材料
實驗所用材料包括:硫酸鏈霉素、多菌靈，購自Sigma公司;甲醇、氯化鈉、無水乙醇、葡萄糖、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂等試劑均為分析純，購自成都市科龍化工試劑公司;野菊花購自成都荷花池中藥材市場.
1.2菌株
1)細菌.白色葡萄球菌(ATCC8799)、表皮葡萄球菌(ATCC35984)、金黃葡萄球菌(ATCC6538)、鼠傷寒沙門氏菌(CMCC50115)、大腸桿菌(ATCC25922)，由成都大學醫學院提供.
2)真菌.蕎麥立枯絲核菌，由成都大學農業部雜糧加工重點實驗室提供.
1.3培養基
1)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(Potatodextroseagar，PDA)用于真菌培養及活性測定，其配方為:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，加去離子水定容至1000mL.
2)營養肉湯培養基(Nutrientbroth，NB)用于細菌的活化及活性測定，其配方為:氯化鈉5g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，加去離子水定容至1000mL，pH值調節至7.4.
1.4儀器
實驗所用儀器包括:AUY-220型電子天平(島津公司)，SXKW型恒溫電熱套(北京中興偉業儀器有限公司)，DHG-9140B型恒溫鼓風干燥箱、GHP-9080型隔水式恒溫培養箱(上�，槍嶒炘O備有限公司)，UPT-II-20T型優普系列超純水器(成都超純科技有限公司)，LDZM-40KCS型立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫療器械廠).
1.5方法
1.5.1野菊花揮發油的提取.
野菊花于50℃低溫烘干，粉碎，采用水蒸氣蒸餾法提取其揮發性成分.稱取一定量的野菊花干粉，按照料水比為1∶10(m/v)的比例，在微沸狀態下提取野菊花揮發油，每次持續5～6h.收集揮發油，往其中加入少許無水硫酸鈉，干燥，除去干燥劑后避光低溫保存，總共提取2kg野菊花干樣，稱重計算揮發油得率.
1.5.2野菊花揮發油的氣相色譜—質譜(GC-MS)分析.
1)色譜條件.色譜柱為毛細管柱，載氣為高純度氦氣，進樣口溫度為290℃，壓力49.5kPa，總流量24.0mL/min，流速1.0mL/min，線速度36.1cm/s.
2)升溫程序.初設溫度40℃，保持5min;以10℃/min升至150℃，保持5min;以5℃/min升至225℃，保持5min;以5℃/min升至250℃，保持2min;以10℃/min升至300℃，保持15min;分流比為20∶1;檢樣器溫度220℃.
3)質譜條件.EI(70eV)，離子源溫度為200℃，掃描范圍為33～700m/z.
1.5.3野菊花揮發油對細菌的抑制活性.
1)揮發油溶液的配制.稱取一定量的野菊花揮發油，溶于30%二甲基亞砜(DMSO)溶液中，配成初始濃度范圍在6.25～100mg/mL的系列溶液，4℃低溫保存，待測.
2)細菌活化.用接種環挑取少量菌種，接種到50mL營養肉湯中，于37℃下培養24～36h，用麥氏比濁管調節細菌濃度至108CFU/mL.
3)利用微量稀釋法測定揮發油對細菌的抑制活性[8].吸取1mL上述菌液于新鮮的50mL營養肉湯培養基中，震蕩搖勻，在潔凈96孔板中加入90μL營養肉湯和10μL樣品溶液，每個濃度重復4次，30%DMSO為陰性對照，硫酸鏈霉素為陽性對照.4)在37℃下，培養24～36h后，用肉眼觀察細菌生長情況，判斷最低抑制濃度(MIC)值，即無細菌生長的孔所對應的揮發油濃度為MIC值.在確定樣品的MIC基礎上，從MIC值所對應的無菌生長的孔以及比MIC濃度更高的孔中各吸取20μL培養液，接種于瓊脂平板上，用三角玻璃涂布鏟輕輕平推，使液體均勻分布，隨后將平皿置于37℃培養24～36h，觀察有無細菌生長，以培養皿中計數少于5個菌落作為藥物的最低殺菌濃度(MBC).
1.5.4野菊花揮發油對蕎麥立枯絲核菌的抑制活性.
1)樣品溶液的配制.準確吸取一定量的揮發油置于潔凈離心管中，用12.5%DMSO溶液依次稀釋，使揮發油初始濃度范圍在5～40mg/mL，每個濃度溶液體積均為1mL.陽性對照為多菌靈，陰性對照為12.5%DMSO.
2)真菌活化.用接種針挑取蕎麥立枯絲核菌菌絲，接種至新鮮的PDA平板中央，25℃暗培養2～3d，待其菌絲剛好長滿平板.
3)利用帶毒平板法測定揮發油對立枯絲核菌的抑制活性[9].將PDA培養基加熱融化，待其溫度降至40～50℃時，將1mL樣品溶液加入裝有49mLPDA培養基的三角瓶中，搖勻，每個三角瓶倒3個平板，靜置.培養基凝固后，用無菌打孔器在上述長滿立枯絲核菌的平板上打孔，然后用接種針挑取菌餅接種到已凝固的培養基上，用封口膜將培養皿封口，于28℃下培養，48h后，采用十字交叉法測量菌落的直徑，記錄數據并計算相對抑制率.
4)數據統計.以供試樣品終濃度對數為橫坐標，抑制率換算成幾率值為縱坐標，求回歸方程(Y=aX+b)，并計算抑制中濃度IC50值.
2結果與討論
2.1野菊花揮發油主要成分分析
實驗采用水蒸氣蒸餾法提取干燥的野菊頭狀花序，收集得到淺藍色的野菊花揮發油成分，其具有野菊花的特殊香味，干燥后稱重計算揮發油得率為0.32%(w/w).經GC-MS分析比對后，共鑒定出36種成分，主要為萜類化合物及其含氧衍生物以及脂肪族化合物，具體結果見表1.
由表1可知，相對含量較高的5種成分為姜黃烯(11.37%)、氧化石竹烯(10.53%)、胡椒酮(8.96%)、α-Copaen-11-ol(7.73%)和(S)-順式馬鞭草烯醇(6.39%)，其占總成分相對含量的44.98%.此外，左旋樟腦、左旋龍腦、α-松油醇、石竹烯、桉油烯醇、巴倫西亞橘烯等化合物的相對含量均在1%以上.
2.2野菊花揮發油對細菌的抑制活性
本研究采用微量肉湯稀釋法測定了野菊花揮發油對5種臨床常見致病細菌的抑菌活性，結果如表2所示.
表2數據顯示，在供試濃度范圍下，野菊花揮發油對3株革蘭氏陽性葡萄球菌和2株革蘭氏陰性腸道桿菌的生長均表現出了一定抑制活性.總體而言，野菊花揮發油對革蘭氏陽性球菌的抑制能力稍強于陰性腸道桿菌，對白色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抑制活性相對較好，其MIC值均為1.25mg/mL，MBC值為2.5mg/mL，對金黃色葡萄球菌的抑制活性稍弱，MIC值為2mg/mL，MBC值為2.5mg/mL.野菊花揮發油對鼠傷寒沙門氏菌的MIC和MBC值分別為2.5mg/mL和5mg/mL，其對大腸桿菌的MIC和MBC值分別為5mg/mL和10mg/mL.
2.3野菊花揮發油對立枯絲核菌的抑制活性
本研究采用帶毒平板法測定了野菊花揮發油對蕎麥立枯絲核菌的抑制活性，結果如圖1所示.
圖1結果顯示，野菊花揮發油對立枯絲核菌菌絲生長具有很好的抑制作用，且隨著濃度增加，抑制作用隨之增強，并呈現出一定的量效關系.在設定終濃度為0.024mg/mL條件下，野菊花揮發油對蕎麥立枯絲核菌的抑制率超過50%，而濃度為0.096mg/mL時，其對蕎麥立枯絲核病菌菌絲生長的抑制率高達80%.在此基礎之上，進一步測定了野菊花揮發油對立枯絲核菌的抑制中濃度，其IC50值為0.02mg/mL(回歸方程Y=1.7191X+1.3794).
期刊推薦：《成都大學學報》(自然科學版)是成都大學主辦的自然科學類綜合性學術刊物，國內外公開發行，主要刊登生物與食品工程、電子工程、計算機工程、機械工程、土木與建筑工程、環境與能源工程及相關的交叉學科和相應的基礎理論等自然科學和工程技術方面的學術論文、研究報告、綜述、技改成果等。
3結論
野菊為多年生草本藥用植物，在我國的分布較為廣泛.本研究采用水蒸氣蒸餾法提取制備了野菊花中的揮發性成分，并采用氣相色譜—質譜(GCMS)聯用的方法對野菊花揮發性成分進行了分析鑒定.研究表明，野菊花揮發油的主要成分為萜類及其衍生物，其相對含量高于10%的成分主要為姜黃烯和氧化石竹烯.此外，胡椒酮、左旋樟腦、α-Copaen-11-ol、(S)-順式馬鞭草烯醇、左旋龍腦、α-松油醇、石竹烯、桉油烯醇和巴倫西亞橘烯等18個化合物的相對含量也在1%以上.同時，本研究采用不同的抗菌活性檢測模型測定了野菊花揮發油的抑菌活性，結果表明，野菊花揮發油對3種革蘭氏陽性葡萄球菌和2種革蘭氏陰性桿菌均表現出了一定的抑制作用，其中揮發油對白色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抑制活性相對較好，其MIC值僅為1.25mg/mL，充分展現出了野菊花揮發油在醫藥領域有著較好的應用潛力.此外，本研究首次報道了野菊花揮發油對蕎麥立枯絲核菌的抑制活性，其抑制中濃度IC50值低至0.02mg/mL，表現出了較好的開發利用價值，可為蕎麥立枯病等病害新型防治藥劑的研制提供新的思路.
SCISSCIAHCI
