發布時間：2019-12-05所屬分類：農業論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要一氧化氮(NO)作為信號分子，在抵御重金屬脅迫中起重要作用，但對不同離子脅迫下的解毒機制尚缺乏研究.本研究采用營養液培養法，研究了銅(Cu)、鎘(Cd)單一或復合脅迫下，番茄幼苗對Cu、Cd的吸收轉運特性及對外源NO的響應機制.結果表明:50molL-1的Cu2+、Cd
摘要一氧化氮(NO)作為信號分子，在抵御重金屬脅迫中起重要作用，但對不同離子脅迫下的解毒機制尚缺乏研究.本研究采用營養液培養法，研究了銅(Cu)、鎘(Cd)單一或復合脅迫下，番茄幼苗對Cu、Cd的吸收轉運特性及對外源NO的響應機制.結果表明:50μmol·L-1的Cu2+、Cd2+均顯著抑制番茄植株的生長，其中Cd脅迫對生長的抑制效應遠高于Cu脅迫.Cu、Cd單一或復合脅迫均使番茄根系Cu、Cd含量顯著升高，但根系對Cu、Cd吸收存在嚴格選擇性.根細胞對必需元素Cu表現出“奢侈吸收”的現象，而對毒性較強的Cd則吸收相對較少，胞內Cd濃度僅為Cu的1/10左右.外源NO處理可不同程度地緩解Cu、Cd脅迫，其中緩解Cd脅迫的效能更強.番茄對被動進入細胞的Cu、Cd具有相似的解毒機制:一方面，Cu、Cd脅迫誘導細胞質中產生谷胱甘肽(GSH)、植物螯合肽(PCs)和金屬硫蛋白(MTs)，絡合過多的Cu、Cd離子，降低其生物毒性;另一方面，過多的Cu、Cd離子或螯合物被轉運至液泡區隔化.外源NO通過調控GSH-GSSG(氧化型谷胱甘肽)氧化還原狀態及GSH-PCs代謝方向的改變，促進Cu、Cd離子轉運至液泡區隔化來緩解脅迫抑制;NO還可誘導植株葉片或根系表達更多的金屬硫蛋白、GSH和PCs，而且上述響應普遍存在疊加效應.這可能是NO介導番茄對Cu、Cd脅迫的另一主要解毒途徑.
關鍵詞番茄;銅脅迫;鎘脅迫;一氧化氮;谷胱甘肽;植物螯合肽
銅(Cu)是高等植物必需微量元素，同時也是重金屬，過量Cu會對細胞產生毒害作用.Cu礦的開采和冶煉廠三廢的排放、含Cu農業化學物質(殺菌劑、殺蟲劑和化肥)和有機肥(高Cu豬糞、雞糞和廄肥)的施用常使農田土壤，特別是溫室土壤含Cu量達到一般農田土壤的幾倍乃至幾十倍[1-2].鎘(Cd)是植物非必需元素，且是毒性最強的重金屬，即使濃度極低也會對細胞產生毒害.這些重金屬元素通常結合在生物大分子的活性位點，取代酶活性中心的金屬離子，改變酶的活性，從而破壞其代謝功能[3].植物螯合肽(phytochelatin，PCs)是細胞中廣泛存在的小分子多肽，富含半胱氨酸，其巰基可與細胞中的重金屬離子形成螯合物，降低自由離子對細胞的生物毒性.PCs最早是從鎘離子誘導的蛇根木(Rauvolfiaserpentina)懸浮細胞中提取到的鎘結合多肽.PCs與源于動物的金屬硫蛋白(metallothioneins，MTs)(同樣富含半胱氨酸)的差異在于PCs不是基因的產物，而是以谷胱甘肽(glutathione，GSH)為前體催化合成.GSH在重金屬毒害中具有雙重作用，既是一種重要的抗氧化劑，又是PCs合成的直接前體，而PCs清除H2O2的能力是GSH的5～6倍[4].這些螯合劑通常存在于細胞質中，是植物應對重金屬脅迫的重要機制.
土壤重金屬元素有Cd、Cu、Hg、As、Cr、Pb等，離子種類對不同螯合劑的誘導程度存在很大差異.Cu2+、Cd2+均帶有二價正電荷，雖然不是伴生金屬，但二者均是土壤中最為常見的污染元素.污染土壤中的金屬離子常以復合脅迫的形式存在，其相互作用(表現為拮抗效應、疊加效應或協同效應)直接影響植物對金屬離子的累積和不同層次上的生物毒性[5]，這種互作在理化性質相似的離子之間更為顯著[6].一氧化氮(NO)作為一種信號分子，參與多種重金屬脅迫的響應機制，在植物重金屬解毒機制中起重要作用[7-8].番茄(Solanumlycopersicum)是廣受人們喜愛的蔬菜，在城市郊區及設施栽培等重金屬污染較重的區域普遍栽培.本研究以番茄為試驗材料，采用營養液培養，探索外源NO緩解番茄Cu、Cd脅迫的機制，為揭示Cu、Cd互作及復合重金屬脅迫的解毒機理提供理論依據.
1材料與方法
1.1供試材料
供試番茄品種為“改良毛粉802F1”，購自登海五岳泰山種業有限公司.Hoagland改良營養液組成為Ca(NO3)2·4H2O、KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4、FeSO4·7H2O、EDTA-Na、微量元素，以上試劑均為分析純，用蒸餾水配置.NO供體為硝普鈉([Na2Fe(CN)5]NO，SNP)，購自Sigma公司，Cu2+、Cd2+分別由CuCl2、CdCl2提供，先用蒸餾水配成200μmol·L-1的母液，4℃避光保存，用時按所需濃度稀釋.
1.2試驗設計
試驗在山東農業大學智能溫室栽培床上實施，種子經55℃溫湯浸種消毒15min，然后在潤濕的吸水紙上28℃催芽.待種子露白后，播于洗凈的細砂中，于育苗盤中培養，出苗后用1/4Hoagland改良營養液澆灌.當幼苗長出3～4片真葉時，挑選生長一致的植株洗凈根部細砂，移栽于盛有1/2Hoagland改良營養液的塑料桶(5.0L)培養，每桶定植5株.預培養1周，換成完全營養液.每3d更換1次營養液，低濃度KOH或HCl調節pH至(5±0.2).營養液培養期間用電動氣泵24h連續通氣.
當植株長至5～6片真葉時，對番茄幼苗進行脅迫處理.試驗設置7個處理:1)完全營養液(對照，CK);2)50μmol·L-1CuCl2，Cu脅迫處理(Cu);3)50μmol·L-1CuCl2+100μmol·L-1SNP，NO緩解處理(Cu+S);4)50μmol·L-1CdCl2，Cd脅迫處理(Cd);5)50μmol·L-1CdCl2+100μmol·L-1SNP，NO緩解處理(Cd+S);6)50μmol·L-1CuCl2+50μmol·L-1CdCl2，Cu和Cd脅迫處理(Cu+Cd);7)50μmol·L-1CuCl2+50μmol·L-1CdCl2+200μmol·L-1SNP，NO緩解處理(Cu+Cd+S).每處理重復3次，隨機排列.處理8d后收獲植株根系及葉片.部分鮮樣用于測定酶活性，部分樣品液氮速凍，-80℃貯存備用.
1.3測定項目與方法
1.3.1植物亞細胞組的分離及各亞細胞組分Cu、Cd含量測定采用離心法對番茄根系亞細胞組分(細胞壁、細胞器及細胞可溶性組分)進行分離[9].并將分離的各組分分別轉移至三角瓶，電熱板蒸干，再加入5mL濃硝酸消煮，50mL容量瓶定容，原子吸收分光光度計(島津AA3700)測定Cu、Cd.
1.3.2γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECS)和谷胱甘肽合成酶(GS)活性測定γ-ECS活性采用試劑盒(購自南京建成)測定;GS活性采用試劑盒(購自江萊生物)測定.
1.3.3植物螯合肽、谷胱甘肽及金屬硫蛋白(MTs)含量測定PCs測定采用差減法[10]，公式為:PCs=(TNP-SH)-(GSH-GSSG).非蛋白質態巰基總量(TNP-SH)含量測定利用Ellman試劑進行定量[11].還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的測定參照郝建軍等[12]的方法;MT含量測定采用銀飽和分析法[13].
1.4數據處理采用MicrosoftExcel軟件對數據進行處理及繪圖，采用DPS統計軟件的Duncan極差法對平均數進行多重比較(α=0.05).
期刊推薦：《應用生態學報》是中國科學院主管、中國生態學學會和中國科學院沈陽應用生態研究所聯合主辦的綜合性學術期刊，創刊于1990年，由科學出版社出版。內容主要包括：森林生態學、農業生態學、草地生態學、漁業生態學、海洋與濕地生態學、資源生態學、景觀生態學、全球變化生態學、城市生態學、產業生態學、生態規劃與生態設計、污染生態學、化學生態學、恢復生態學、生態工程學、生物入侵與生物多樣性保護生態學、流行病生態學、旅游生態學和生態系統管理等。讀者對象主要：從事生態學、地學、林學、農學和環境科學研究、教學、生產的科技工作者，有關專業學生及經濟管理和決策部門的工作者。有投稿需求的作者，可以直接與期刊天空在線編輯聯系。
2結果與分析
2.1外源NO對不同Cu、Cd脅迫下番茄幼苗生長的影響由表1可知，50μmol·L-1Cu、Cd單一脅迫和復合脅迫均使番茄生物量顯著降低，其中Cd的毒害效應顯著高于Cu.與對照相比，Cd處理下番茄地上部和根系的生物量降幅均最大(分別為50.3%、48.1%).Cu+Cd復合脅迫下，番茄地上部與根系生物量分別比對照降低30.8%和18.7%，但與單一脅迫相比，復合脅迫地上部生物量較Cu單一脅迫降低13.4%，較Cd單一脅迫反而增加28.2%，差異顯著.外源NO對Cd單一脅迫下番茄地上部和根系生表1外源NO對不同Cu、Cd脅迫下番茄幼苗生長的影響Table1EffectsofexogenousNOonthegrowthoftomatoseedlingsunderdifferentCu，Cdstress處理Treatment地上部鮮質量Shootfreshmass(g·plant-1)根系鮮質量Rootfreshmass(g·plant-1)株高Shootheight(cm·plant-1)CK32.52±0.76a9.53±0.71a35.70±0.41aCu25.97±0.28b6.95±1.57b33.30±0.23aCu+SNP29.80±0.23a7.70±0.77b34.47±0.54aCd16.15±0.44d4.95±0.67c12.00±0.95bCd+SNP21.40±0.12c7.25±0.46b36.43±0.55aCu+Cd22.50±0.47c6.85±0.45b29.58±0.81aCu+Cd+SNP20.10±0.032c7.82±0.52b31.23±0.57a不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)Differentsmalllettersmeantsignificantdifferenceamongtreatmentsat0.05level.下同Thesamebelow.物量的抑制緩解效應最顯著，而對Cu單一脅迫和Cu+Cd復合脅迫下番茄地上部和根系生物量的抑制緩解效應不明顯.與對照相比，不同Cu、Cd脅迫處理均降低番茄株高，其中Cd單一脅迫處理降幅最顯著(達67.1%).外源NO一定程度上可緩解Cu、Cd脅迫對番茄莖伸長的抑制作用，Cd單一脅迫下添加NO番茄株高恢復最為明顯(為Cd脅迫的3倍)，株高甚至超過對照.而Cu單一脅迫和Cu+Cd復合脅迫下添加外源NO對株高的影響均不顯著.
2.2外源NO對Cu、Cd脅迫下番茄根系Cu、Cd亞細胞分布的影響
由表2可知，正常營養條件下，Cu較為均勻地分布在根系亞細胞的各個組分.與對照相比，Cu單一脅迫和Cu+Cd復合脅迫下細胞壁、細胞器、可溶性組分Cu含量均顯著增加.Cu單一脅迫下各部位Cu含量分別為對照的5.53、2.75和9.35倍，而復合脅迫下各部位含量分別為對照的4.64、6.25和10.33倍.可見，進入細胞的Cu呈急劇增加的趨勢，尤其是各細胞器組分的增幅最大.不同Cu、Cd脅迫處理下，可溶性組分的Cu濃度均最高.添加外源NO后，Cu單一脅迫下的番茄根系細胞器和可溶性部分Cu含量分別下降33.3%和9.3%，差異顯著，但未恢復至對照水平;Cd單一脅迫下各亞細胞組分亦不同程度降低，細胞器中Cu降幅最大(75.2%)，其次是細胞壁(31.9%);Cu+Cd復合脅迫下添加外源NO使細胞壁和可溶性部分Cu含量繼續升高，而細胞器中則降低8.6%.
與對照相比，Cd單一脅迫處理的細胞壁和細胞器中Cu含量分別降低12.2%和3.1%，可溶性部分有增加的趨勢(5.9%)，說明正常營養條件下添加過量Cd2+，可部分取代細胞器及組織上的結合位點，促進有限的Cu2+轉向可溶性組分，但差異并不顯著.Cd單一脅迫和Cu+Cd復合脅迫下，過多的Cd更多分布于細胞可溶性組分，Cu+Cd復合脅迫下，細胞器和可溶性組分Cd含量比Cd單一脅迫高出84.9%和37.2%，表明Cd脅迫下添加Cu有促進Cd吸收的趨勢.添加外源NO后，Cd單一脅迫亞細胞各組分Cd含量繼續升高，細胞壁、細胞器和可溶性組分分別升高27.3%、38.5%和57.9%.Cu+Cd復合脅迫處理在添加外源NO后各部位Cd含量亦有升高的趨勢，但只有可溶性組分增幅顯著(達22.3%)
以上分析顯示，外源NO對Cd脅迫下Cu、Cd吸收的調控幅度普遍大于Cu脅迫.無論是Cu單一脅迫還是Cd單一脅迫，外源NO對Cu的吸收呈現抑制的趨勢;不管是Cd單一脅迫還是Cu+Cd復合脅迫，外源NO對Cd的吸收呈現促進的趨勢.
2.3外源NO對Cu、Cd脅迫下番茄γ-ECS和GS活性的影響
由圖1可知，不同Cu、Cd脅迫處理在一定程度上可使番茄根系和葉片γ-ECS活性顯著提高，且Cu和Cd單一脅迫下葉片的γ-ECS活性普遍高于根系.與對照相比，Cu+Cd復合脅迫下根系γ-ECS活性達到最高，比Cu、Cd單一脅迫分別提高120.1%和41.5%;葉片中γ-ECS活性的變化趨勢與根系相反，復合脅迫分別比Cu、Cd單一脅迫降低8.3%和24.4%.無論根系還是葉片，Cu單一脅迫在添加外源NO后，γ-ECS活性均顯著提高(分別恢復65.6%和12.6%).Cu+Cd復合脅迫下添加外源NO后γ-ECS活性的變化趨勢與Cd單一脅迫相近，根系和葉片γ-ECS活性分別降低12.1%和28.5%.
與對照相比，不同Cu、Cd脅迫處理均顯著提高番茄GS活性，其中Cu+Cd復合脅迫比Cu、Cd單一脅迫GS活性高，根系和葉片分別比對照提高57.6%和65.1%，比Cu單一脅迫提高39.5%和42.2%，比Cd單一脅迫提高40.5%和68.4%.添加外源NO對不同Cu、Cd單一脅迫和復合脅迫下GS活性均有促進作用，其中根系GS活性增幅較大，分別比未施NO處理增加73.1%、59.3%和45.4%.
2.4外源NO對Cu、Cd脅迫下番茄GSH和GSSG含量及GSH/GSSG的影響
由圖2可以看出，番茄根系中，Cd單一脅迫下GSH含量比對照提高10.8%，而Cu單一脅迫和Cu+Cd復合脅迫下，GSH含量分別降低12.6%和37.9%，差異顯著.添加外源NO對根系Cu、Cd單一脅迫下的GSH含量影響不顯著，但顯著提高復合脅迫下根系GSH含量(提高80%).葉片中，Cu單一脅迫GSH含量大幅下降，Cd單一脅迫和Cu+Cd復合脅迫GSH含量無顯著變化，但添加外源NO后，Cu、Cd單一脅迫葉片GSH含量急劇上升，分別增至脅迫處理的3.0和1.5倍，超出了對照.而Cu+Cd復合脅迫下添加外源NO后，葉片GSH含量則減少至原來的54.3%，與根系GSH含量驟升的趨勢相反.
與對照相比，根系中，Cu單一脅迫下GSSG含量顯著上升，添加NO后GSSG含量反而下降.Cd單一脅迫下，番茄GSSG含量有所降低，添加NO后有所回升，但差異均不顯著;與對照相比，Cu+Cd復合脅迫GSSG顯著降低，添加外源NO后繼續下降;葉片中，Cu單一脅迫的GSSG升高至對照的2.1倍，添加外源NO后GSSG含量回落至對照水平.Cd單一脅迫下，葉片GSSG含量有所降低，添加外源NO后顯著回升，甚至高于對照，而Cu+Cd復合脅迫下添加外源NO后葉片GSSG含量亦顯著回升(增加86.9%).根系和葉片GSSG、GSH含量變化對NO的響應呈現互為消長的趨勢，說明Cu、Cd脅迫誘導GSH/GSSG的氧化還原過程.
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