發布時間：2019-05-17所屬分類：科技論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：利用菌絲拮抗反應、酯酶同工酶以及ISSR分子標記對35個金針菇菌株進行多相分類研究，建立了遺傳相似性聚類分析圖。結果表明：拮抗反應與ISSR分析結果較為一致，而酯酶同工酶與拮抗反應、ISSR分析結果差異較大，ISSR聚類分析結果更為精確。根據ISSR聚類
摘要：利用菌絲拮抗反應、酯酶同工酶以及ISSR分子標記對35個金針菇菌株進行多相分類研究，建立了遺傳相似性聚類分析圖。結果表明：拮抗反應與ISSR分析結果較為一致，而酯酶同工酶與拮抗反應、ISSR分析結果差異較大，ISSR聚類分析結果更為精確。根據ISSR聚類分析，當相似系數為0.86時，可將供試菌株分為7組，其中黃色金針菇的遺傳多樣性要高于白色金針菇。
關鍵詞：金針菇;菌株;多相分類
金針菇(Flammulinavelutipes(Fr.)Sing.)是我國主栽菇種之一，也是當前我國工廠化生產的重要菇種，深受消費者喜愛。在食用菌生產中，選用優良菌種是實現高產優質的基本前提，目前市場上名目繁多的金針菇品種，部分來自野生菌株系統選育，少數出自單胞雜交，更多的則是利用食用菌具有無性繁殖的特點，通過各種翻版、復制、更名而來，菌種同種異名、異種同名現象嚴重，給科研、生產帶來選材上的困擾。
食用菌的分類主要依據形態、交配親和性、生化特性以及分子生物學等手段。“多相分類”一詞是由COL-WELL[1]提出的，它主要是對微生物的表型、遺傳型以及系統發育關系等各個方面可用于鑒別的特征進行研究并加以綜合分析。多相分類方法在細菌分類研究中應用較多[2-3]，在大型食用真菌分類鑒定研究中尚鮮見系統報道。該研究通過拮抗反應、酯酶同工酶、ISSR分析結合子實體形態特征對收集的35個金針菇菌株進行了多角度比較分析，以期為金針菇遺傳育種、生產應用提供技術參考。
1材料與方法
1.1試驗材料
復合PDA培養基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，麥麩10g，蛋白胨3g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，瓊脂20g，水1000mL。
1.2試驗方法
1.2.1菌絲拮抗試驗參照文獻[4]的方法進行。
1.2.2酯酶同工酶參照文獻[5]的方法進行。
1.2.3ISSR分析
菌絲體制備：將供試金針菇菌株轉接到復合PDA平板培養基上隔膜培養10d后，刮取菌絲置-20℃貯存備用。DNA提�。翰捎肂iospin真菌基因組DNA提取試劑盒進行提取。引物篩選：以菌株W1和Y1作為篩選模板進行ISSR引物篩選，供試引物均購自上海生工生物工程公司。退火溫度篩選：以W1為模板，在梯度擴增儀上設置最小溫度50.1℃，最大溫度58.4℃，自動形成10個梯度，篩選最佳退火溫度。
PCR擴增：采用20μL反應體系：1μLDNA模板，1μLPrimer，10μL2×PCRMasterMix(TIANGEN)，8μLddH2O。PCR擴增程序為：94℃預變性5min;94℃變性30s，相應退火溫度退火45s，72℃延伸90s，35次循環;72℃延伸7min;4℃保存。電泳檢測：PCR產物在1×TAE緩沖液中用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠在制膠時加入，用分子量MarkerⅢ指示DNA譜帶的大小及相對位置，穩壓(5V·cm-1)電泳1h后于凝膠成像系統拍照記錄。
1.3數據分析
將每個樣品的擴增條帶按有或無記錄，擴增條帶存在時賦值為1，不存在時賦值為0，為了消除可能的假陽帶，在采集ISSR譜帶時，舍棄小于200bp和大于3000bp的DNA非穩定區的譜帶。利用NTSYS-pc聚類分析軟件對各菌株進行聚類分析，構建35個菌株的聚類分析圖。
2結果與分析
2.1金針菇不同菌株間菌絲拮抗反應
根據拮抗試驗結果可將供試菌株分為15個菌組，其中包含2個及2個以上菌株的有4組：W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W14、W15、W16、W17為一組(白)，W8、W18為一組(白)，W13、W19為一組(白)，Y1、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y9、Y15為一組(黃)，組內菌株相互之間不拮抗或拮抗反應不明顯，說明菌株間親緣關系很近;而W9、W10、W11、W12、Y2、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14、Y16菌株與其它菌株(組)間均相互拮抗，可認定為有區別性的獨立菌株。一般白色菌株與黃色菌株間拮抗反應明顯，但菌株Y8表現特殊，與多個白色菌株拮抗不明顯，其遺傳系譜有待于進一步研究確定。
2.2酯酶同工酶酶譜分析
從酯酶同工酶電泳圖譜可以看出，酯酶同工酶圖譜獲得的條帶較多，多態性較豐富。在同工酶譜帶中有一個Rf=0.35的共同酶帶，是所有金針菇菌株(白、黃)共有的，可以作為金針菇的標志性酶帶。在Rf=0.44和Rf=0.40這2條酶帶上，白色品種基本都有，而黃色品種除Y11、Y12、Y13這3個菌株外其它菌株基本沒有或者比較弱。根據酯酶同工酶譜帶的有無，采用相似系數法進行聚類分析，得到樹狀圖。
當相似系數為0.8時，可將供試菌株分為6組。W1、W2、W3、W4、W5、W8、W10、W11、W13、W14、W15、W16、W17、W18、W19、Y11、Y12、Y13為一組，共18個菌株;Y1、Y2、Y3、Y4、Y6、Y7、Y8、Y9、Y10、Y14、Y15為一組，共11個菌株;W6、W7為一組;W9、W12、Y16各自獨立為一組。但Y11、Y12、Y13與白色菌株聚為了一大組，其原因有待于進一步深入分析。
2.3ISSR分析
從28個ISSR引物序列中篩選出了10個擴增穩定性強、條帶清晰、多態性豐富的引物，對供試的35菌株進行了PCR擴增。10個引物共擴增出79條DNA條帶，其中具有多態性帶57條，占總帶數的72.2%，平均每個引物擴增出7.9條帶。根據擴增條帶的有無，利用NTSYS-pc聚類分析軟件對各菌株進行聚類分析。
當相似系數為0.86時，可將供試菌株分為7組：W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W14、W15、W16、W17為一組，共12個菌株;W9、W10、W12、W13、W18、W19為一組，共6個菌株;Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、Y8、Y9、Y15為一組，共9個菌株;Y12、Y13、Y14、Y16為一組，共4個菌株;Y10、Y11為一組，共2個菌株;W11、Y1各自獨立為一組。
聚類結果表明，部分菌株之間的相似性非常高，如菌株W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7之間，相似系數為1.00，說明它們之間親緣關系很近，可能存在同物異名。ISSR聚類分析結果與拮抗反應的吻合度較高，黃色菌株與白色菌株分別優先聚合，未發生混合現象，說明ISSR聚類分析結果更為精確。
3討論與結論
真菌的拮抗反應是體細胞不親和的直接體現，是由基因組內異核體不親和(het)位點控制的，是最常用的食用菌菌種鑒定方法[6-7]。同工酶是基因在代謝水平上的表型，作為一種生化指標，被廣泛應用于食用菌種間、種內的分類鑒定[8-9]，ISSR是一種基于微衛星序列發展起來的分子標記，具有簡便、穩定、多態性高等優點，已被廣泛應用于種質資源鑒定、遺傳多樣性分析、特異性標記等方面[10-11]。
該研究中拮抗反應與ISSR分析結果的一致性較高，而酯酶同工酶與二者的一致性較差。供試菌株中有3個黃色菌株其酯酶同工酶帶型更接近于白色菌株，黃晨陽等[12]、王波等[13]在利用酯酶同工酶研究金針菇菌株的遺傳多樣性時也發現了個別黃色金針菇的親緣關系與白色菌株更近。不同菌株酯酶圖譜不但在條帶的有無上存在差異、還在條帶的強弱上存在差異，僅按酶帶的有無對菌株進行鑒別存在一定的局限性。
在該試驗中，沒有發生拮抗線、拮抗溝或隆起等典型拮抗反應的試驗組合中，也能觀察到菌絲生長形態的明顯不同，這說明該供試菌株遺傳背景差異還是有的，只是未表現出菌絲間的強烈拮抗，因此拮抗試驗只能用于菌株的初步判定。利用ISSR可以實現對不同菌株的區分，其中白色菌株聚為一大組、黃色與淺黃色菌株聚為一大組，說明淺黃色菌株與黃色菌株的親緣關系更近。綜合拮抗反應、酯酶同工酶圖譜和ISSR圖譜分析表明，供試金針菇菌株遺傳多樣性較為豐富，其中黃色菌株的遺傳多樣性要高于白色菌株，多個白色菌株的親緣關系較近或為同一個菌株，這可能與目前國內使用的白色菌株其來源主要是從日本引進或從日本白色金針菇子實體中分離而來有關。而黃色菌株其來源主要是本地野生馴化、雜交選育或國外引進再加篩選獲得的菌株，其來源較為多樣化。
參考文獻
[1]COLWELLRR.PolyphsictaxonomyofthegenusVibrio：NumericaltaxonomyofVibriocholerae，Vibrioparahaemolytic-us，andrelatedVibriospecies[J].JBacteriol，1970，104：410-433.
[2]李衛民，劉毅，牛天貴，等.分枝桿菌的多相分類鑒定[J].國外醫藥(抗生素分冊)，2007(2)：64-69.
[3]姚竹云，陳文新.多相分類技術在根瘤菌分類中的應用(綜述)[J].農業生物技術學報，1998(2)：61-65.
[4]中華人民共和國農業部.NY/T1845-2010食用菌菌種區別性鑒定拮抗反應[S].北京：中國農業出版社，2010.
[5]中華人民共和國農業部.NY/T1097-2006食用菌菌種真實性鑒定酯酶同工酶電泳法[S].北京：中國農業出版社，2006.
[6]劉盛榮，張維瑞，柯斌榕，等.基于拮抗試驗的杏鮑菇菌株分類研究[J].食藥用菌，2015，23(1)：33-36.
[7]馬瑜，申堅定，宋君鋒，等.羊肚菌不同栽培品種間拮抗試驗反應[J].中國食用菌，2017，36(5)：80-82.
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