發布時間：2021-04-27所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要：目的通過研究環狀RNAcircAKT3對骨肉瘤細胞生物學行為的影響，來明確circAKT3在骨肉瘤進展中的作用。方法將骨肉瘤細胞分為實驗組和對照組，實驗組轉染circAKT3的siRNA序列，對照組轉染siRNANC(negativecontrol)序列。采用qRTPCR驗證轉染效果，后續采
摘要：目的通過研究環狀RNAcircAKT3對骨肉瘤細胞生物學行為的影響，來明確circAKT3在骨肉瘤進展中的作用。方法將骨肉瘤細胞分為實驗組和對照組，實驗組轉染circAKT3的siRNA序列，對照組轉染siRNANC(negativecontrol)序列。采用qRTPCR驗證轉染效果，后續采用CCK8實驗檢測兩組細胞的增殖能力，采用流式細胞儀檢測兩組細胞的凋亡率，采用Transwell侵襲和遷移實驗分別檢測兩組細胞的侵襲和遷移能力。采用qRTPCR檢測患者骨肉瘤及瘤旁組織中circAKT3的表達水平，然后分析骨肉瘤組織中circAKT3的表達水平與骨肉瘤患者臨床相關病理參數的相關性。結果qRTPCR檢測結果顯示，實驗組SOSP9607細胞中circAKT3的表達水平較對照組明顯降低(P<0001)。CCK8實驗和流式細胞儀凋亡檢測結果顯示，實驗組SOSP9607細胞的增殖能力較對照組明顯降低(P<005)，而凋亡率則明顯升高(P<0001)。Transwell結果顯示，實驗組SOSP9607和U2OS細胞的侵襲和遷移能力較對照組明顯降低(P<001)。骨肉瘤組織內circAKT3的表達水平較瘤旁組織明顯升高(P<001)。骨肉瘤組織內circAKT3的表達水平與患者的臨床分期和轉移呈正相關(P<005)。結論circAKT3可以增強骨肉瘤細胞的惡性生物學行為，促進骨肉瘤的進展。
關鍵詞：環狀RNA;circAKT3;骨肉瘤;增殖;凋亡;侵襲;遷移
作為最常見的惡性骨腫瘤之一，骨肉瘤主要發生于兒童和青少年[1，2]。骨肉瘤具有高度侵襲性，很容易出現早期轉移[3]。近年來，雖然新輔助療法和輔助化療已在臨床中廣泛使用，但是仍不能完全抑制腫瘤的生長，使骨肉瘤的死亡率依然處于較高水平[4]。因此，在針對骨肉瘤的治療中，迫切需要發掘新的治療手段和靶點。
環狀RNA(circularRNA，circRNA)是一類新的非編碼RNA分子，其廣泛存在于真核細胞的細胞質中[5]。不同于線性RNA分子，circRNA作為環狀閉合分子，具有高度的穩定性[6]。circRNA具有多種功能，例如調節剪接和轉錄，結合蛋白以及轉運RNA[7，8]。最近的研究表明，眾多circRNA在多種腫瘤中表達異常，且其異常表達與腫瘤的進展密切相關，在腫瘤中充當癌基因或抑癌基因[9]。作為circRNA家族中的一份子，circAKT3可促進胃癌和肺癌的進展[10，11]。在之前的研究中，我們在細胞層面證實，circAKT3可促進骨肉瘤U2OS細胞的增殖和抑制細胞凋亡[12]。骨肉瘤作為具有高度侵襲能力的惡性腫瘤，circAKT3是否可以抑制骨肉瘤侵襲和轉移，具有重要研究意義。除了在U2OS細胞系，在其他骨肉瘤細胞系是否具有同樣作用，且其在臨床層面是否同樣具有癌基因作用，都需要進一步去研究。本實驗就以上問題進行了驗證，旨在進一步明確circAKT3在骨肉瘤中的癌基因作用，也為臨床骨肉瘤的治療提供可靠有效的治療靶點。
1方法和材料
11臨床標本采集
2016年3月至2018年12月在唐都醫院骨科收集42例骨肉瘤組織標本以及10例相應瘤旁組織標本，術前均征得患者同意并簽署同意書，患者術前均未進行過放化療。標本取出后，立即放入-80℃進行保存。
12細胞系及培養條件
骨肉瘤SOSP9607細胞系由唐都醫院骨科建立，并在骨科骨腫瘤研究所進行保存[13]。U2OS細胞系購于ATCC(Americantypeculturecollection，美國模式培養物集存庫)。SOSP9607細胞系采用含有10%胎牛血清(杭州四季青公司)的RPMI1640培養基(美國Hyclone公司)進行培養，而U2OS細胞系則采用含有10%胎牛血清的DMEM培養基(美國Hyclone公司)進行培養。所有細胞均在37℃、含有5%CO2濃度的飽和濕度的細胞培養箱(美國Thermo公司)內進行培養。
13細胞轉染及分組
根據LipofectamineTM2000的操作手冊對骨肉瘤SOSP9607和U2OS細胞的circAKT3siRNA序列及siRNANC(negativecontrol)序列進行轉染，轉染均在6孔板(美國Corning公司)內進行。circAKT3的siRNA序列和siRNANC序列購至廣東銳博生物科技有限公司。
后續將骨肉瘤細胞分為實驗組和對照組，實驗組細胞轉染circAKT3的siRNA序列，而對照組細胞則轉染siRNANC序列。
14qRTPCR檢測骨肉瘤組織及細胞中circAKT3的表達水平
采用TRIzol溶液(美國Sigma公司)對骨肉瘤組織和細胞進行裂解，其中在SOSP9607細胞轉染效率的驗證部分，在細胞轉染24h后進行裂解。在獲取細胞和組織內的RNA后，采用5×AllInOneRTMasterMix試劑盒進行反轉錄，從而獲得相應的cDNA。最后采用EvaGreenExpress2×qPCRMasterMix試劑盒進行qPCR。引物序列如下：circAKT3上游5′-TCCAAATAAACGCCTTGGTGG-3′，下游5′-CCTCAGAGAACACCCGCTCT-3′;GAPDH上游5′-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′，下游5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3′。
15CCK8實驗檢測骨肉瘤細胞的增殖能力
待兩組細胞轉染24h后，將細胞鋪于96孔板，每孔4000細胞，每組每個時間點鋪8復孔，共鋪4板，分別用于鋪板后24，48，72，96h的檢測。在檢測前，每孔加入10μlCCK8溶液(日本同仁公司)，然后將孔板置于細胞培養箱1h，最后上機檢測兩組細胞在450nm波長處的光密度值(opticaldensity，OD)。16流式細胞儀凋亡檢測實驗檢測骨肉瘤細胞的凋亡率采用AnnexinⅤFITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶公司)進行檢測。待兩組細胞轉染48h后，1ml的1×BindingBuffer重懸細胞兩次，取100μl細胞懸液加入實驗管中，加入5μlAnnexinⅤFITC溶液后，室溫下避光孵育10min。每管中繼續添加5μlPI溶液，室溫下避光孵育5min。添加預冷PBS將每管補至500μl后上機檢測。
17Transwell侵襲實驗檢測骨肉瘤細胞的侵襲能力
待Matrigel基質膠(美國BD公司)融化后，采用OPTIMEM(美國Gibco公司)培養基進行1∶8稀釋，然后取50μl稀釋后基質膠鋪于Transwell小室(美國Corning公司)內，全程在冰上進行，鋪膠后十字搖晃，以保證鋪膠均勻。然后將鋪膠后小室置于細胞培養箱中放置1h，此時基質膠會發生凝固。
相關期刊推薦：《山西醫科大學學報》JournalofShanxiMedicalUniversity(月刊)曾用刊名：山西醫學院學報，1959年創刊，醫學類綜合性學術刊物，主要刊登基礎醫學、預防醫學、臨床醫學方面的科研成果及工作經驗。自創辦以來，受到了醫學教育界的廣泛好評。主要刊登我�？萍既藛T及校友在基礎醫學、預防醫學、藥學、臨床醫學等方面的科研成果及經驗報告和綜述等。
在細胞轉染48h后，添加相應無血清培養基離心收集6孔板內實驗組和對照組細胞，計數3次，取平均值，然后將5×104細胞懸浮細胞添加至Transwell小室內，并添加相應無血清培養基將小室內體積補至200μl。然后在Transwell小室下孔板內添加600μl含有20%胎牛血清的相應培養基。
在細胞培養箱培養20h后，取出小室，棉簽去除基質膠，然后采用95%乙醇固定10min，繼續采用05%結晶紫溶液染色5min，最后在倒置顯微鏡下進行觀察。
18Transwell遷移實驗檢測骨肉瘤細胞的遷移能力
除了Transwell小室不鋪Matrigel基質膠，且在細胞培養箱培養12h后即取出小室進行觀察外，余同Transwell侵襲實驗。
19統計學分析
實驗結果采用SPSS220軟件(美國IBM公司)進行統計分析，并采用GraphPadPrism70進行作圖。計量資料采用均數±標準差表示。CCK8實驗部分結果采用twowayANOVA檢驗進行分析，42例患者骨肉瘤組織中circAKT3的表達水平與骨肉瘤臨床相關病理參數的相關性實驗部分結果采用Fisher確切概率法進行分析，10例骨肉瘤患者腫瘤及相應瘤旁組織中circAKT3表達水平檢測結果采用pairedStudentt檢驗進行分析，余實驗結果采用twotailedStudentt檢驗進行分析。P<005被認為差異具有統計學意義。
2結果
21circAKT3的siRNA在骨肉瘤SOSP9607細胞中轉染效率的驗證
qRTPCR實驗結果顯示，實驗組在轉染circAKT3的siRNA后，其細胞內circAKT3的表達水平較對照組明顯降低，差異有統計學意義(P<0001，見圖1)，說明轉染有效，可以用于后續實驗。
22抑制circAKT3的表達可抑制骨肉瘤SOSP9607細胞的增殖能力
CCK8結果顯示，實驗組在轉染siRNA抑制circAKT3的表達后，其細胞在72h和96h的增殖能力明顯降低，差異有統計學意義(P<005，見圖2)。
23抑制circAKT3的表達可增加骨肉瘤SOSP9607細胞的凋亡率
流式細胞儀凋亡檢測實驗結果顯示，實驗組細胞的凋亡率較對照組明顯升高，差異有統計學意義(P<0001，見圖3)。
24下調circAKT3表達可抑制骨肉瘤SOSP9607和U2OS細胞的侵襲能力
Transwell侵襲實驗結果表明，實驗組在下調SOSP9607和U2OS細胞內circAKT3的表達后，細胞的侵襲能力較對照組也明顯降低，差異有統計學意義(P<001，見圖4)。
25下調circAKT3表達可抑制骨肉瘤SOSP9607和U2OS細胞的遷移能力
Transwell遷移實驗的結果同Transwell侵襲實驗一致，較之對照組，實驗組細胞的遷移能力明顯降低，差異有統計學意義(P<001，見圖5)。
26circAKT3在骨肉瘤組織中表達明顯增高
對10對骨肉瘤組織及相應的瘤旁組織進行circAKT3表達水平進行檢測，結果顯示，骨肉瘤組織中circAKT3的表達水平較瘤旁組織明顯升高，差異有統計學意義(P<001，見圖6)。
27circAKT3表達水平與骨肉瘤臨床相關病理參數的相關性
實驗選擇42例骨肉瘤組織進行了circAKT3表達水平的檢測，以其表達水平的平均值為標準，將其分為circAKT3高、低表達組，并分析了circAKT3的表達水平與骨肉瘤患者的年齡、性別、分期、大小及是否有轉移等相關臨床病理參數的關系。結果顯示，circAKT3的表達水平與骨肉瘤患者的臨床分期和轉移呈正相關，即骨肉瘤高臨床分期和發生轉移患者的骨組織中circAKT3的表達水平更高(P<005，見表1)。
3討論
隨著circRNA在腫瘤中的研究已成為熱點，越來越多的circRNA被證實參與了腫瘤的發生和發展，成為腫瘤治療的潛在新的靶點，為腫瘤的治療提供了新的思路[14]。日益增多的研究表明，circRNA在骨肉瘤中同樣也作為腫瘤發生和發展的重要參與者。例如，circMYO10在骨肉瘤中高表達，其作為癌基因可促進骨肉瘤增殖、侵襲和遷移[15]。此外，circ-0100876在骨肉瘤中表達被抑制，低表達的circ-0100876在骨肉瘤中作為抑癌基因可抑制骨肉瘤的惡性生物學行為[16]。而在之前的研究中，circAKT3被證實可促進骨肉瘤U2OS細胞的增殖和抑制細胞凋亡[12]。本實驗同樣證實了circAKT3可以促進SOSP9607細胞的增殖和抑制細胞凋亡，證實了circAKT3在骨肉瘤細胞系中作用具有一定普遍性。骨肉瘤作為高度侵襲性惡性腫瘤，很多患者在就診時已經出現轉移，如何抑制骨肉瘤轉移具有重要現實意義。在本實驗中，我們在SOSP9607和U2OS細胞系中證實了circAKT3可促進骨肉瘤的侵襲和遷移，是骨肉瘤促轉移的參與者。綜上，我們在細胞層面證實了circAKT3在骨肉瘤增殖、凋亡、侵襲和遷移等多個生物學行為中的促進作用。
除了在細胞層面，實驗在臨床標本層面證實了骨肉瘤中circAKT3的表達水平明顯高于其瘤旁組織，同樣提示了circAKT3在臨床中的癌基因潛質。后續通過分析42例骨肉瘤患者組織中circAKT3的表達水平，結果表明，circAKT3的表達水平與骨肉瘤的臨床分期以及轉移事件的發生呈正相關，明確了circAKT3在骨肉瘤臨床中的癌基因角色。需要看到的是，雖然circAKT3在細胞層面可促進細胞增殖，但是在此次臨床樣本統計中，其高表達與腫瘤大小的差異無明顯關系�？紤]其一可能是樣本例數不足，未能準確反映其相關性;其二可能受骨肉瘤患者的就診時間影響較大，以致臨床很難準確反映兩者的相關性。綜上，臨床層面的研究結果同細胞層面研究基本相一致，都證實了circAKT3在骨肉瘤中的促進作用，兩者的一致性，也證實了研究的可靠性。
隨著對circRNA的研究日益深入，關于其下游作用機制的研究也越發深入。大量的miRNA被證實為circRNA的下游靶點，circRNA通過海綿吸附miRNA的作用已被廣泛報道。例如，circ-0060428通過海綿吸附miR375進而解除后者對基因RBPJ的抑制作用，最終促進骨肉瘤的進展[17]。同樣，circHIPK3通過作用于miR637/STAT3軸進而促進骨肉瘤轉移[18]。而circAKT3是否同其他很多circRNA一樣存在下游miRNA，需要進一步研究。
綜上，在前期研究的基礎上，本實驗進一步在細胞層面證實了circAKT3可促進骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和抑制凋亡，此外，在臨床標本層面中，骨肉瘤中circAKT3的表達水平與骨肉瘤的臨床分期和轉移事件發生呈正相關。本研究進一步證實了circAKT3在骨肉瘤中的癌基因角色，為骨肉瘤的臨床治療提供了潛在有效的治療靶點。——論文作者：張開亮1，2，韓康3，陳明2，信波4，李大河1
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