發布時間：2019-12-10所屬分類：醫學論文瀏覽：1次
摘 要： 摘要:目的建立一種超臨界流體色譜方法拆分調血脂藥阿托伐他汀鈣與其對映異構體雜質，并對對映異構體雜質進行含量測定。方法采用ACQUITYUPC2TrefoilCEL2色譜柱(3.0mm150mm，2.5m)，以超臨界二氧化碳/含0.1%三氟乙酸的甲醇(78/22，V/V)為流動相，背壓為13.8MPa
摘要:目的建立一種超臨界流體色譜方法拆分調血脂藥阿托伐他汀鈣與其對映異構體雜質，并對對映異構體雜質進行含量測定。方法采用ACQUITYUPC2TrefoilCEL2色譜柱(3.0mm×150mm，2.5μm)，以超臨界二氧化碳/含0.1%三氟乙酸的甲醇(78/22，V/V)為流動相，背壓為13.8MPa，進樣量為4μL，柱溫為45℃，流速為1.5mL·min-1，于244nm波長處分離阿托伐他汀鈣及其對映異構體。結果阿托伐他汀鈣與其對映體在5min內均已出峰完全，分離度達4.1，對映體在2.5～50μg·mL-1內線性關系良好，相關系數為0.9999(n=6)。對映體的檢測限與定量限分別為1.0μg·mL-1(S/N=3)和2.5μg·mL-1(S/N=10);阿托伐他汀鈣原料藥中對映異構體的平均加樣回收率為100.40%。結論利用超臨界流體色譜分離阿托伐他汀鈣手性雜質與使用普通液相色譜相比可極大縮短分離時間，減少有機溶劑的使用量，重現性好，可有效用于阿托伐他汀鈣的質量控制。
關鍵詞:阿托伐他汀鈣;對映體雜質;超臨界流體色譜;手性拆分
阿托伐他汀鈣是一種調血脂藥，是HMG-CoA還原酶的選擇性及競爭性抑制劑，可有效降低純合子家族性高膽固醇血癥患者的低密度脂蛋白水平[1]�！队幍洹�2017版(BP2017)、《歐洲藥典》9.0版(EP9.0)、《美國藥典》40版(USP40)均收載阿托伐他汀鈣，均制定了對映體雜質檢查項，《中國藥典》2015年版未收載此藥。阿托伐他汀鈣結構中有兩個手性中心，藥理活性成分為阿托伐他汀鈣(R，R)型，結構式見圖1，其余3個異構體均為雜質，其中非對映異構體(R/S，S/R)在國外藥典有關物質項條件下可與其他雜質同時實現分離，而對映異構體(S，S)型(對映體)則采用正相色譜系統進行分離檢測。
超臨界流體色譜(SFC)以超臨界流體做流動相，因具有較強的溶解能力，及良好的傳質能力，可利用其溶劑化能力來進行分離分析。SFC兼具氣相色譜和液相色譜的特點，相比普通液相而言能獲得更快更好的分離分析效率，在難以實現快速良好分離的中藥成分和手性藥物中均有較大優勢[2-3]。SFC采用二氧化碳作流動相最大的局限性在于無法分離極性大的化合物，有些無法洗脫的化合物需通過加入改性劑和少量添加劑來實現分離洗脫。目前有報道采用高效液相分離阿托伐他汀鈣及對映體[4-5]，分離時間達數十分鐘，而采用SFC進行快速手性拆分的方法尚沒有報道。
本實驗擬采用超臨界流體色譜法結合手性固定相對阿托伐他汀鈣及其對映體雜質進行拆分，并對原料藥中對映體的量進行定量測定。
1儀器與試藥
WatersAcquityUltraPerformanceConvergenceChromatography(UPC2)系統，光電二極管陣列檢測器(PDA)。BP211D型精密天平(Sartorius公司)。Trefoil系列色譜柱如下:ACQUITYUPC2TrefoilCEL1，ACQUITYUPC2TrefoilCEL2，ACQUITYUPC2TrefoilAMY1，3根色譜柱規格相同(3.0mm×150mm，2.5μm)。甲醇、乙醇、乙腈、三氟乙酸均為色譜純。二氧化碳(純度99.99%)。
阿托伐他汀鈣對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:100590-201303，純度95.3%)，阿托伐他汀鈣對映體雜質對照品(EDQM，批號:Y0001332)，阿托伐他汀鈣消旋體混合物對照品[RANBAXY，B.NO:SYK(D-716)36，Chromatographicpurity:98.5%，Chiralpurity:Enantiomer44.1%，Atorvastatin55.9%]。阿托伐他汀鈣原料藥3批:2批由BSMsinochem(LotNo:3141400240，3141400257)提供，1批由RANBAXYLaboratories(LotNo:2743173)提供。
2方法與結果
2.1溶液的配制
2.1.1對照品溶液精密稱取對映體雜質對照品2.5mg于25mL量瓶中，加甲醇5mL振搖溶解，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度為0.1mg·mL-1的對映體儲備液。精密量取適量用乙醇稀釋制成10μg·mL-1的對映體對照品溶液。
2.1.2系統適用性溶液精密稱取阿托伐他汀鈣對照品30mg于10mL量瓶中，加乙醇少量振搖溶解后精密加入對映體儲備液1mL，用乙醇稀釋至刻度，制成含阿托伐他汀鈣3.0mg·mL-1，對映體雜質10μg·mL-1的系統適用性溶液。
2.1.3供試品溶液精密稱取3批阿托伐他汀鈣原料適量，加少量甲醇溶解后用乙醇定量稀釋混勻制成每1mL含3.0mg的溶液，作為供試品溶液。
2.2色譜條件及系統適用性
色譜柱篩選初始色譜條件為:流動相為CO2/甲醇(80/20，V/V);流速:1.0mL·min-1;背壓:13.8MPa;柱溫40℃;進樣量:1μL;檢測波長:244nm。測定色譜條件為:色譜柱采用ACQUITYUPC2TrefoilCEL2(3.0mm×150mm，2.5μm);流動相為CO2/0.1%TFA-甲醇(78/22，V/V);流速為1.5mL·min-1;背壓為13.8MPa;柱溫45℃;進樣量4μL;檢測波長為244nm。
取系統適用性溶液進樣4μL，色譜圖見圖2，阿托伐他汀鈣與其對映體分離度為4.19。
2.3檢測限與定量限
精密量取“2.1”項下對映體對照品溶液，進行逐級定量稀釋，進樣量4μL，以信噪比S/N分別為3和10計算，檢測限為1.0μg·mL-1，定量限為2.5μg·mL-1。
2.4線性與范圍
精密量取“2.1”項下對映體儲備液，用乙醇定量稀釋制成含對映體分別為2.5、5.0、8.0、12.5、25.0、50.0μg·mL-1的線性溶液，按“2.2”項下色譜條件分別進樣4μL，記錄色譜圖，以對映體峰面積為縱坐標，質量濃度(ρ，μg·mL-1)為橫坐標，進行線性回歸，結果表明，對映體在2.5～50μg·mL-1內與峰面積呈良好線性關系，回歸方程為Y=4404.1ρ-2273.1，r2=0.9999(n=6)。
2.5日內與日間精密度
對含對映體分別為低(5.0μg·mL-1)、中(10.0μg·mL-1)、高(50μg·mL-1)3個濃度的對映體溶液進行日內(n=6)和日間精密度(d=3，n=6)考察，按“2.2”項下色譜條件進行測定，日內精密度低、中、高3個濃度的相對標準偏差(RSD)分別為1.14%、0.89%和2.03%，日間精密度低、中、高3個濃度RSD分別為2.28%、0.82%和2.01%。
2.6穩定性試驗
取系統適用性溶液分別于配制后0、1、3、5、8、12h測定，記錄色譜圖，結果顯示，阿托伐他汀鈣峰面積RSD為2.72%，對映體峰面積的RSD為1.87%，對映體占阿托伐他汀鈣峰面積百分比的RSD為1.30%(n=6)，表明溶液在12h內穩定。
2.7供試品測定
取兩家企業的3批原料藥按“2.1”項下方法配制，每批平行制備3份，按“2.2”項下方法進行測定，均未檢出對映體，色譜圖見圖3。
2.8回收率試驗
精密稱取同一批號(2743173)原料藥9份，每份約相當于阿托伐他汀鈣30mg，分別置于10mLFig.3SFC-PDAChromatogramofatorvastatincalciumcrudedrug(Lot.2743173)量瓶中，分為3組，每組各加入對映體儲備液0.60、0.90和1.20mL(其中0.90mL加入量參照《歐洲藥典》中的對映異構體雜質限度0.3%計算)，加乙醇振搖溶解，稀釋至刻度。按供試品測定項進行測定，記錄色譜圖及峰面積進行計算，結果見表1。平均回收率為100.40%，RSD為1.91%(n=9)。
3討論
3.1色譜柱的選擇
取少量消旋體對照品用甲醇溶解，在“2.2”項色譜柱篩選初始色譜條件(流動相為CO2/甲醇(80/20，V/V);流速:1.0mL·min-1;背壓:13.8MPa;柱溫40℃;進樣量:1μL;檢測波長:244nm)下對3根手性色譜柱AMY1[直鏈淀粉-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)]、CEL1[纖維素-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)]、CEL2[纖維素-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)]進行考察，固定相結構見圖4。結果顯示，在AMY1和CEL1色譜柱上目標物質在15min內出峰，但主峰與異構體雜質峰完全重合無法分離，在CEL2色譜柱上目標物質在10min內出峰且主峰與雜質峰完全分離，分離度達4.6，見圖5。推測原因可能是固定相對溶質的立體選擇性。手性固定相中最重要的手性吸附位置為氨基甲酸酯部位，阿托伐他汀鈣中手性中心上的羥基可與固定相上的氨基或羰基形成氫鍵，根據空間位置的差異從而實現手性識別，AMY1和CEL1中固定相上的苯環引入推電子基團甲基時，會使羰基活性增強;而CEL2中苯環上引入吸電子基團氯時會使氨基活性變高，從結構上觀察推測阿托伐他汀鈣手性中心上羥基與固定相上羰基作用時的空間位阻比其與氨基作用時大，從而使阿托伐他汀鈣在CEL2上的手性識別能力比在AMY1和CEL1上好。最終選擇色譜柱CEL2進行后續條件優化。
3.2溶劑的選擇
考察甲醇、乙醇、乙腈和異丙醇4種溶劑對阿托伐他汀鈣測定的影響，結果表明，阿托伐他汀鈣在甲醇中溶解，在乙醇中微溶，在乙腈和異丙醇中不溶;對映體在甲醇中溶解，在乙醇中微溶。但因阿托伐他汀鈣用甲醇溶解放置20h后，在主峰相對保留時間0.86處會產生一未知降解雜質，見圖6。綜合考慮阿托伐他汀鈣與對映體在溶劑中的溶解度與穩定性，最終選用少量甲醇作為溶解溶劑用于樣品粉末的初步溶解，選用乙醇作為稀釋溶劑用于樣品溶解后的定量稀釋。相比EP9.0和BP2017中先分別用甲醇溶解對映體、無水乙醇/甲醇(50/50)溶解供試品后用無水乙醇稀釋、正己烷定容的制備步驟，本實驗選取的制備步驟更簡便。
3.3流動相的優化
二氧化碳臨界溫度31℃，臨界壓力7.29×106Pa，對溫度、壓力有寬的選擇范圍，是最易獲得的超臨界流體之一，且對各類有機分子溶解性較好。在二氧化碳中添加改性劑可改善分離的選擇性。分別以體積分數20%的異丙醇、乙腈、乙醇、甲醇為改性劑，在其他色譜條件相同的情況下，以甲醇為改性劑時，可獲得良好分離度，選擇甲醇為改性劑進一步優化比例與添加劑。嘗試在改性劑中加入微量添加劑三氟乙酸，可使峰寬變窄，保留時間縮短。當以CO2/含0.1%三氟乙酸的甲醇(78/22，V/V)為流動相，背壓為13.8MPa，柱溫為40℃，流速為1.5mL·min-1時，阿托伐他汀鈣與對映體可獲得良好峰形與分離度，綜合考慮保留時間、分離度，選擇上述條件作為流動相。相比USP40、BP2017和EP9.0中采用正己烷-無水乙醇-三氟乙酸(940∶60∶1，V/V/V)作流動相，文獻[4]中采用正己烷-無水乙醇-三氟乙酸(93∶7∶0.1，V/V/V)作流動相，本實驗采用的流動相配制更簡便，相同流速條件下有機溶劑使用量減少75%以上，更綠色環保。
3.4背壓、流速、柱溫與進樣量的優化
分別考察了1.0、1.2、1.5mL·min-1的流速，35、40、45℃的柱溫，13.8、15.2和17.2MPa的背壓對分離結果的影響，結果顯示，提高流速對峰分離度沒有顯著影響且可以使保留時間提前，改善峰形;背壓對保留時間、分離度及峰形的影響均不顯著;溫度升高，峰寬減小，信噪比增加。綜合考慮最終選用1.5mL·min-1的流速，13.8MPa的背壓和45℃的柱溫作為最終分離條件。
本實驗考察了不同進樣量對阿托伐他汀鈣與對映體的峰形影響，取系統適用性溶液在優化后的色譜條件下分別進樣1、2、3、4、5μL，結果表明，在進樣量加大至5μL情況下會出現超載現象，色譜圖中主峰與對映體峰峰形均較差，因此在不發生超載的前提下為盡可能提高檢測靈敏度，選擇進樣量為4μL。
4結論
采用此超臨界流體色譜方法對不同企業的3批進口原料藥進行測定，均未檢出對映體。建立的方法可在4min內完成阿托伐他汀鈣與對映體雜質的完全拆分與雜質的測定，相比文獻[4-5]中采用正相色譜條件約40min的拆分方法，此方法具有分離時間短，分離效率高，樣品配制與操作簡便，有機試劑用量少等優點，從進樣到完成分離的過程中采用此方法的有機溶劑使用量僅為國外藥典標準條件中有機溶劑使用量的3%左右，實現了超臨界流體色譜在分析技術領域中綠色環保的理念，為阿托伐他汀鈣中對映體雜質的質量控制和研究提供更快更有效的選擇。
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